替尔泊肽制造：序列组装、脂化与杂质控制

替尔泊肽（tirzepatide）是一条39个残基的合成多肽，C端为酰胺，其两个赖氨酸中的一个带有一条以二十碳脂肪二酸结尾的支链合成侧链。欧洲审评记录对结构的描述十分精确：该肽以GIP序列为基础，在第2位和第13位含有氨基异丁酸，C端为酰胺，第20位赖氨酸（Lys20）的ε-氨基通过一个由γ-谷氨酸和两个8-氨基-3,6-二氧杂辛酸单元构成的连接单元与1,20-二十烷二酸相连（EMA (CHMP), Assessment Report: Mounjaro, EMA/791310/2022, 21 July 2022, p. 13）。原研发现论文给出相同的结构（T. Coskun et al., Molecular Metabolism 2018, 18, 3–14），已获批的美国说明书亦然（FDA, MOUNJARO (tirzepatide) injection — prescribing information, §11）。

有一条边界必须首先划定。论文和专利披露的是开发路线与工艺概念，并不必然描述礼来（Eli Lilly）当前的商业生产工艺。 这一点在本例中格外重要，因为公开资料中存在三种不同的东西——一条经同行评审的公斤级混合路线、一个同时披露线性路线与汇聚路线的专利族，以及监管机构对2022年注册工艺的描述——而它们并非都在描述同一套化学。

一句话概括本文论点：替尔泊肽难以制造，并不是因为其中任何单一反应前所未见（没有一个是），而是因为序列保真度、立体化学完整性、位点特异性脂化与纯化选择性必须在一条长而化学上不均一的多肽上同时成立。其中任何一项出现微小失误，都可能产生一个长度正确、分子量接近、却难以去除的终产品杂质。

替尔泊肽既是多肽，也是位点特异性缀合物

被制造的对象是一条序列，加上在特定位点、以特定方式连接的特定侧链——而后半部分自带其供应链、杂质谱与分析负担。EPAR中的系统化学名称精确地确定了其拓扑结构：自Lys20的ε-氮向外读取，连接单元依次为 AEEA → AEEA → γ-谷氨酸 → C20二酸，其中谷氨酸通过其γ-羧基连接，α-氨基被二酸酰化，α-羧基保持游离。原研化合物专利将同一连接关系写作两个 [2-(2-amino-ethoxy)-ethoxy]-acetyl 单元、一个 γGlu 和 CO–(CH₂)₁₈–CO₂H（US9474780B2, GIP and GLP-1 co-agonist compounds, Eli Lilly and Company, priority 9 January 2015, granted 25 October 2016）。两份文件在顺序上互相印证很重要，因为顺序装错的连接单元是一个分子量非常接近、但本质不同的分子。

读取同一名称还能得到若干塑造整个制造问题、而综述通常省略的事实。该序列含有两个赖氨酸：Lys20带有侧链，而在已定义的结构中 Lys16 未被修饰。序列不含半胱氨酸，也不含甲硫氨酸，这在两个具体方面界定了杂质空间——不存在需要形成和控制的二硫键，甲硫氨酸氧化也不是该序列的一条途径。但由此并不能推出不存在氧化风险：Trp25 和两个酪氨酸仍然是对氧化和烷基化敏感的位点。四个残基为甘氨酸，两个为 Aib，均无手性——EPAR 记载天然氨基酸为 L 构型，而 Gly 与 Aib 无手性中心。

结构特征	制造后果	控制含义	证据等级
39个残基，C端酰胺化	约38次偶联和数量相近的脱保护，每一次都是产生缺陷的机会	逐步完成度需实测监控，而非假定	官方资料；步数为算术推算
第2位和第13位为 Aib	既是受阻的酰化试剂，装上之后其α-氨基又是受阻的亲核体	在这些位点及其邻近需产品专属条件	位置来自官方资料；两条公开路线都单独处理 Ile12→Aib13
Aib 与 Gly 无手性中心	六个位点不会发生差向异构化；相关集合是另外33个手性α-碳加侧链的 γGlu 手性中心	立体化学控制是位点特异的	无手性由 EPAR 记载；计数由该名称推导
两个赖氨酸；Lys20 为已定义修饰位点	选择性酰化必须被设计出来，这正是采用正交保护的原因	Lys20 使用正交保护；Lys16 保留至最终裂解	两个赖氨酸均见于 EPAR 名称。若正交性失效，Lys16 被酰化的物种在结构上是合理的，但并非本文所查阅资料中已报告的杂质
Lys20 上的支链侧链	第二条合成与供应链汇入同一个分子	需要自身的质量标准与变更控制	组成来自官方资料；缀合相关要求见 EMA 指南

表1. 替尔泊肽的结构特征、各自在制造上的代价，以及每一条关联的公开证据强度。

39个残基的序列造成累计装配问题

逐步合成具有汇聚路线所没有的一个性质：每一个循环都会相乘。在不把它当作收率预测的前提下，可以用一个理想化表达式看清量级：

理想化的全长分子比例 ≈（单步成功率）^（装配事件数）

对一条线性39肽，主链偶联约为38次。若理想化地取单步99.5%，则 0.995³⁸ ≈ 83%；取99.0%，则 0.990³⁸ ≈ 68%。把脱保护也算作独立的机会，指数大致翻倍：0.995⁷⁶ ≈ 68%，0.990⁷⁶ ≈ 47%。反向推算，要求就变得清晰——要在38次偶联后保住90%的完整链，每一步需要约99.72%。

这些数字只是示意，而且在多个方向上都是错的。各步既不独立——聚集会让一次失败的偶联更可能引出下一次——也不同等高效，因为公开路线恰恰是在特定位点采用不同条件，正说明平均值在那里并不成立。该表达式还只覆盖链组装，完全没有涉及裂解、侧链安装、沉淀、色谱或分离中的损失。

一个公开的公斤级数字可以作为校正：在原研工艺专利中，以 Sieber 酰胺树脂为载体的线性 SPPS 实施例报告分离得到14.5 kg替尔泊肽，HPLC纯度大于97.7%，肽含量88.4%，以树脂载量计总收率为46%（WO2020159949A1, Process for preparing a GIP/GLP1 dual agonist, Eli Lilly and Company, priority 29 January 2019, published 6 August 2020, Example 4B）。同一实施例在纯化之前更有说服力：对于以 Preparation 24 计、规模描述为32 kg的两个批次，该专利报告粗品分别为24.4 kg和21.3 kg，HPLC纯度分别为69.5%和88.3%。这些是申请人对该公开实施例给出的数字，并非该分子的一般性质。从70%–90%区间的粗品到高于97%的放行品，这段差距就是整条纯化链需要完成的工作。

多肽文献把这一点说得很直白——由于固相合成是逐步过程、误差在合成中累积叠加，它无法与生物表达的模板化保真度相比（R. Behrendt, P. White, J. Offer, Advances in Fmoc solid-phase peptide synthesis, J. Pept. Sci. 2016, 22, 4–27）。正是这一差距使得治疗性多肽开发与多肽工艺开发不可分割：发现阶段做出的序列决定，会永久性地设定装配负担。

为什么长链 SPPS 放大后更困难

长链固相合成的困难，并不是毫克级困难的放大版：有些只在链变长时出现，另一些只在反应器变大时出现。树脂结合态聚集是一种普遍而且常常重要的困难，不过本文所查阅的资料并未确立它就是替尔泊肽制造中的主导失效模式。随着链的增长，树脂结合肽之间的氢键会使溶剂化状态塌缩，正在延长的N端变得更难接近。Fmoc 综述将此表述为肽在树脂上溶解性变差的再现，并得出结论认为多肽合成的主要障碍就是肽的聚集——这一主题在难合成序列文献中有充分展开（M. Paradís-Bas, J. Tulla-Puche, F. Albericio, The road to the synthesis of "difficult peptides", Chem. Soc. Rev. 2016, 45, 631–654）。聚集并不是一种独立的杂质机理，而是作用在其他机理之上的乘数：难以接近的氨基导致偶联不完全并产生缺失，被屏蔽的 Fmoc 基团导致脱保护不完全并在别处产生另一处缺失。

标准的缓解手段是结构性的而非程序性的：主链酰胺保护与假脯氨酸二肽都通过打断氢键化的二级结构起作用，并曾针对难合成序列做过比较（S. C. F. Sampson, W. Patsiouras, N. J. Ede, J. Pept. Sci. 1999, 5, 403–409）。这在本例中不是假设：该工艺专利的N端片段就是用覆盖第4位和第5位的 Gly-Thr 假脯氨酸二肽搭建的。

放大还带来与序列无关的约束。固相合成消耗溶剂和试剂的量与树脂体积成正比，而不是与产品质量成正比——这正是更绿色的多肽原料药工艺被列为关键未满足需求的原因（A. Isidro-Llobet et al., J. Org. Chem. 2019, 84, 4615–4628）——而向溶胀聚合物内部的传质并不会因为搅拌更剧烈而改善，因此在实验室验证过的偶联在生产反应器中可能表现不同，这与支配小分子原料药放大的技术转移问题是同一个问题。

有一个结构性差异改变了控制哲学。在常规合成中，一步出错会在下一次分离时被抓住；在线性 SPPS 中，直到裂解之前都没有分离，因此装配过程中可获得的全部信息，就是过程控制在树脂上能看到的内容——这正是公开实施例要设定诸如经紫外确认 Fmoc 脱除大于99%、以及在连接侧链之前残留受保护赖氨酸低于1%这类目标的原因。

非天然残基同时改变化学与物料控制

Aib——2-氨基异丁酸，或称2-甲基丙氨酸——是在α-碳上多了一个甲基的丙氨酸，而这一取代同时做了两件事。

在化学上，α,α-双取代使该残基两侧都受阻：Fmoc-Aib-OH 是受阻的酰化试剂，而一旦装上，其α-氨基又成为下一个残基必须酰化的受阻亲核体。两份独立的原研披露——都在描述替尔泊肽本身，也都使用相同的残基编号——对其中一个连接点的处理与其邻近位点不同。化合物专利的实验室实施例在第12位用 PyBOP 和 DIEA 偶联 Fmoc-Ile-OH，25 °C下24小时，而默认条件为90分钟——即向 Aib13 上偶联。工艺专利的公斤级线性实施例记载，当工艺整体由 NMP 改为 DMF 时，Ile12 到 Aib13 的偶联是唯一保留 NMP 的步骤。两份披露都以加强的偶联条件处理该连接点，这是产品专属的证据，表明该处获得了额外的工艺关注。它不能证明该键在常规条件下无法形成，也不能证明每一条通往替尔泊肽的路线都必须这样处理。

同一专利还指出该实施例在别处需要帮助之处，称"Extended couplings (4h each) for Pro31, Trp25, Gln24, Val23, Phe22, Lys20, Gly4, Glu3 and Aib2"对于改善粗肽质量是必要的——39个位点中有九个，集中在 Phe22–Pro31 段以及 Aib2 附近。这是申请人对其自身操作的陈述，而该文件本身声明其实施例不构成限制：它是一个窗口，显示在那条路线中哪些位点出现阻力，而不是一项普遍要求。

在立体化学上，Aib 的表现与"非天然残基"可能引发的联想相反：由于其α-碳上带有两个相同的甲基，它没有手性中心，也不会发生差向异构化，EPAR 即如此记载。因此与差向异构化相关的集合是天然残基的33个手性α-碳，加上侧链中 (22S) 构型的 γ-谷氨酸手性中心。三个异亮氨酸和两个苏氨酸的β-手性中心由构建单元而非偶联决定，因此属于原料属性。

Aib 也不是大宗商品：非蛋白源构建单元有各自的合成路线、供应商和有关物质谱，其中任何一项的变更都是原料药工艺的变更。已通过的欧洲指南要求，对在偶联过程中能够像母体化合物一样反应的起始物料杂质，必须在起始物料质量标准中加以控制和限定，并评估其在工艺中的走向与清除（EMA, Guideline on the Development and Manufacture of Synthetic Peptides, EMA/CHMP/CVMP/QWP/367182/2025, adopted 4 December 2025, in effect 1 June 2026）。这与支配寡核苷酸制造中原料确认的"反应性优先"逻辑相同，其可迁移性只基于一个理由：两种平台都是由重复添加构建单元来装配产品，因此一个可被掺入的构建单元杂质会变成产品相关杂质，而不是工艺相关杂质。两种平台在其他方面并不等同——化学、连接类型和分析问题都不相同。

起始物料的选择遵循 ICH Q11，其关于固相载体的条款指出，当多肽在树脂上搭建时，"there is a more limited relationship between risk and number of steps from the end of the manufacturing process"（ICH, Q11, Step 4, 1 May 2012）——因此在本例中，早期的构建单元缺陷并不自动属于低风险。有两项构建单元属性值得点名，因为常规纯度方法看不到它们：Fmoc-氨基酸中带入的乙酸会永久性地封端正在延长的链，而 RP-HPLC 检测不到它，洁净装配要求其水平低于0.02%；而衍生物中的游离氨基酸可能导致某个残基被掺入两次，形成插入序列。两者都在该 Fmoc 综述中有记载。

Lys20 是一个制造节点

这个分子的许多困难都集中在一个残基上。要求是：酰化 Lys20 的ε-氨基，而不是 Lys16 的ε-氨基，也不是N端α-氨基，同时其余部分保持受保护状态。这需要 Lys20 上有一个保护基，能在其他所有保护基都保持不动的条件下脱除——这是严格意义上的正交性，而不仅仅是不同的不稳定性。

公开资料显示同一原研给出了两种正交方案。化合物专利使用 Fmoc-Lys(Alloc)-OH，以催化量 Pd(PPh₃)₄ 和苯硅烷脱除烯丙氧羰基，随后在树脂上用四步延长侧链。工艺专利使用 Fmoc-Lys(ivDde)-OH，以 DMF 中8%水合肼在四小时内脱除——经监控使受保护形式残留低于1%，并以八次 DMF 洗涤清除残余肼——随后将整条侧链作为一个预先组装好的构建单元一次偶联上去。Lys16 带有 Boc 保护基，仅在最终酸解时脱除。

这些差异不是表面的。钯介导的脱保护引入了金属催化剂，而欧洲指南把元素杂质列入使用金属催化剂时应考虑的质量标准项目；肼介导的脱保护则引入了一种活性高、毒理学上值得关注的试剂，必须在引入活化酯之前清除干净——这正是为什么是八次洗涤，而不是象征性地冲一下。

这个节点上有三种失效模式。脱除不完全（Lys20 保护基未脱净）或酰化不完全（成功脱保护之后），都会留下没有侧链的肽链——欧洲指南把游离未缀合肽列为缀合多肽的一项附加质量属性——但两者的控制点不同，前者是脱保护动力学，后者是试剂化学计量。过度反应会产生双酰化物料，该指南在 PEG 语境下称之为双缀合或多缀合，并将其作为一般性缀合风险处理。而如果正交性失效——在酰化之前 Lys16 保护基提前或部分脱落——就会暴露出第二个亲核体。Lys16 被酰化的物种，是正交性失效在结构上合理的后果，而不是本文所查阅公开资料中已报告的杂质；该指南在一般层面指出，非位点特异的缀合产物可能出现，应予控制。

最后这一种情形正是分析论证变得具体的地方，因为它涉及检出它的代价。双酰化链的分子量不同，可被完整分子量分析抓住；而错位物种则不会，因为它与产品共享分子式。观察到预期的分子量，本身并不足以证明侧链连在预期的那个赖氨酸上。 要证明这一点，需要能够定位该修饰的方法——带 MS/MS 的肽图，或针对参考标准品的分离。EPAR 记载的结构确证手段包括 LC-MS、完整分子的 LC-MS/MS、LC-MS 肽图、手性 GC-MS、RP-HPLC 与 IC、NMR、CD、FT-IR、光散射以及基于细胞的生物学测定：这是一组正交方法，而不是单一的分子量测定。

注册工艺中有一项特征需要谨慎表述。EPAR 将该原料药描述为采用"a standard solid phase peptide synthesis (SPPS) manufacturing procedure including addition of the linear sidechain at Lys20"制备，随后将肽自树脂上裂解并同时脱除侧链保护基。因此侧链是在肽仍结合于树脂上时装上的，也就不存在可供放行检验的、已分离的未缀合肽。欧洲指南正是针对这种情形：它把未缀合肽视为一个必须加以控制的中间体，并规定在没有分离出该中间体的情况下，应对所采取的方法作出论证并制定控制策略。树脂上缀合是正当的设计；它把负担转移到过程控制与终产品分析上。

脂肪侧链本身就是一个关键中间体

C20二酸不是以试剂形式到场的。在公开的工艺路线中，它是以完全组装好、带正交保护的构建单元形式到场的：该专利将树脂结合肽与 t-butyl-eicosanedioyl-Glu-(O-tert-butyl)-(8-amino-3,6-dioxaoctanoic acid)-(8-amino-3,6-dioxaoctanoic acid)-OH 偶联。这是一个四组分分子，具有确定的内部顺序、一个手性中心、两个保护基和一个可供活化的游离羧基——本身就是一个小型合成，而该专利中它的制备报告粗品在色谱和结晶之前含有52.3 area%的目标产物。

有若干杂质类别属于这个构建单元而不属于多肽。单个或三个 AEEA 的类似物，或含两个谷氨酸而非一个的构造体，会以一个确定的增量与目标不同，一旦偶联上去就会给出侧链错误的全长肽——原研专利自身的权利要求中就包含一个双 γGlu 变体，说明这类结构在化学上是可及的。谷氨酸手性中心由构建单元固定，并原样传递下去。酰化物种是原位形成的活化酯，残留的活化物料可能在别处发生酰化。而最终酸解中 tert-butyl 酯脱除不完全，会给出一个正确缀合、却多带56个质量单位的肽——这是一种产品相关杂质，再正确的装配也无法避免。

监管上的处理比这个构建单元的体量所暗示的更为严格。欧洲指南指出，活化衍生物可能不适合作为起始物料，其本身可能就是中间体；缀合化学必须在工艺开发部分加以描述；应通过风险分析识别"conjugatable versus non-conjugatable impurities"；而当连接单元来自多个供应商时，应提供各自独立的资料和一份汇总的质量标准。因此，这条侧链不是一个附带检验报告的采购试剂，而是一个带有自身变更控制义务的受控中间体，并且汇入整条工艺中后果最重大的一步。

SPPS/LPPS 混合路线改变了什么

存在一条已公开报道的公斤级混合路线。礼来印第安纳波利斯与 Kinsale 两地的团队报道了一个公斤级 GMP 工艺：四个片段以固相合成制备，再在溶液中连接，并采用连续操作、实时分析监控以及纳滤进行中间体纯化（M. O. Frederick et al., Org. Process Res. Dev. 2021, 25, 1628–1636）。该论文为付费墙文献，本文仅能获取到摘要层面，因此下文关于其单元操作的内容属于摘要级证据。同一机构后来的一篇论文描述了一种"four-fragment convergent hybrid SPPS/LPPS strategy"，其作者称他们开创该策略是为了实现替尔泊肽的商业化合成——这是他们对该策略为何被开发出来的陈述，而不是在陈述它就是目前在用的工艺——该文还补充了一条采用天然化学连接与串联脱硫的双片段路线，在两步操作之间使用切向流过滤，并报告连接反应"without epimerization"进行（A. Jalan et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2026, 65(6)）。其全文同样无法获取。

工艺专利展示了其中的机械装置：片段偶联以进料流在混合器中合并，再通过具有确定停留时间的平推流反应器——偶联在20 °C下停留两小时，随后由二乙胺介导的 Fmoc 脱除停留一小时——并在各次偶联之间以十至二十个渗滤体积进行纳滤，在下一个片段进入之前除去偶联试剂、碱和二苯并富烯。申请人陈述的目标是"an efficient route having fewer steps"。

片段切在哪里，正是公开资料变薄的地方，对此值得严格。2021年的摘要称，所选的四个片段是纯度最高、最易分离的那些；它并未给出片段边界，而在没有全文的情况下，本文不给出这些边界。 其他披露确实指出了一些连接点，但它们属于不同的披露，不应被合并成一个方案：工艺专利的序列表显示了对应于第22–30位和第31–39位的片段，以及一个从 Boc-Tyr1 到 Leu14、带有 Gly-Thr 假脯氨酸的N端片段；而同一机构2025年的一篇论文研究的是定义为第30–39位的C端片段（P. Agrawal et al., Org. Process Res. Dev. 2025, 29, 2896–2907）。另有一个研究组发表了疏水标签辅助的液相路线（Z.-J. Pang et al., Org. Lett. 2025, 27, 10442–10446），而原研也披露脂质部分既可以在片段组装之前连接，也可以在之后连接（EP4017866A1, Eli Lilly and Company, priority 19 August 2019——其实施例涉及的是一般的肠促胰岛素类似物，而不是替尔泊肽）。从这种分散中能够得到的结论不是一张片段图：片段策略重新分配风险，并且可以选择不同的连接点，而一个连接点是关于"在哪里可以干净地完成一次偶联"的设计决定。连续操作现在也有了自己的框架——欧洲指南把这类方法指向 ICH Q13，该文件于2022年11月通过，晚于2021年那篇论文的发表。

	线性 SPPS	SPPS/LPPS 混合路线（按公开披露）
装配	一条树脂结合链，约38次顺序偶联	四条较短的链并行搭建，再在溶液中连接
中间体分离	自上载至裂解之间没有分离	每个片段在偶联前分离并放行
误差在哪里累积	贯穿整条链；任何位置的缺陷都会带到最后	在片段之内，可在此被拒收
新引入的风险	—	每个被活化的片段C端都可能差向异构化；偶联不完全；试剂带入
报告的锚定数字	专利实施例中：14.5 kg，纯度大于97.7%，以树脂载量计收率46%	2021年报告的公斤级 GMP 生产；未获取逐步数字
监管机构描述了什么	2022年 EMA 审评报告把欧盟注册工艺描述为标准 SPPS，并在树脂上于 Lys20 连接侧链——那份审评、那个时点；并不证明今天每一个批次或每个地区所用的路线	本文未查阅到针对该产品混合路线的欧盟审评。2025年 EMA 多肽指南把混合方法视为可接受，并在工艺并行运行时要求可比性数据

表2. 线性与混合装配的对比，取自公开路线。数字均为所引文件中的报告值，而非任一方法的一般性质。

混合制造重新分配风险，但并不消除风险。每一次片段偶联都会在其C端残基上活化一条肽，而这正是该手性中心发生差向异构化的经典条件——这也是"连接反应未发生差向异构化"这一说法值得点明的原因，以及天然化学连接之所以有吸引力的原因。该化学通过连接点处的一个半胱氨酸，在水相中以化学选择性方式连接未保护片段（P. E. Dawson, T. W. Muir, I. Clark-Lewis, S. B. H. Kent, Science 1994, 266, 776–779），而替尔泊肽不含半胱氨酸。原研工艺专利用自己的措辞调和了这一点：它把天然化学连接描述为适用于含有半胱氨酸或丙氨酸的多肽，经由一个瞬态的硫酯连接中间体重排为天然酰胺键；而它自己针对替尔泊肽的连接实施例，是让一个肽酰肼经硫解生成硫酯，再进行自由基引发、不使用过渡金属的脱硫。因此，对于一条不含半胱氨酸的序列，"在丙氨酸位点连接再脱硫"是有据可查的化学——不过究竟是哪一个丙氨酸，无法从本文可获取的资料中确定。

证据边界必须谨慎划定，因为这些文件所说的并不相同。2021年的论文报告了以混合路线进行的公斤级 GMP 生产；2026年论文的作者把"实现商业化合成"作为他们开发四片段策略的理由；支持2022年欧盟上市许可的 CHMP 审评，把注册的原料药工艺描述为标准 SPPS，并在树脂上于 Lys20 连接侧链。这些说法并不必然相互冲突——工艺会在产品生命周期中变化，而审评报告描述的是在那个时点获得注册的内容——但它们是关于不同事物的不同主张，而本文所查阅的公开资料中没有任何内容能确定当前商业生产使用的是哪一条路线。当有多于一条原料药工艺并行运行时，欧洲指南要求提供原料药层面的可比性数据。

于是片段质量就成了终产品质量。每个片段都需要确定的鉴别、纯度、含量以及明确的端基状态——哪一端带哪个保护基，以及是否有保护基脱落。带有缺失的片段一旦偶联，就成为终产品的"全长减一"；在其被活化的C端残基上发生差向异构化的片段，则成为一个非对映异构体；偶联不足1%的片段，会把这1%贡献给最终杂质谱，而后续没有任何一步会优先去除它。片段偶联不完全，会把前一个片段留作一种性质与产品接近的截短物种；而被带入下一步的残留活化物种可能酰化到错误的亲核体上——这正是公开路线要用乙酸淬灭再做纳滤的原因。相差一个残基的同系片段最难控制，因为按有关物质总量设定的质量标准，无法区分一个无害杂质与一个可被掺入的杂质。

替尔泊肽制造的杂质图谱

下面的分类遵循已通过的欧洲指南，该指南按来源划分产品相关杂质——起始物料、制造过程中形成、制造或贮存期间降解——并把它们与非肽杂质（如试剂、溶剂、元素杂质和亚硝胺）区分开。对每一行都有两点提醒。此处列出某一机理，并不等于该杂质在替尔泊肽中以具有实际意义的水平出现——这些机理属于一般多肽化学，凡有来源把某一机理与这个分子联系起来的，表中会明确说明。此外，EPAR 虽然记载了高于 ICH Q3A 界定阈值的杂质已完成界定，但并未公布清单，因此任何一行都不应被读作注册质量标准。

阶段	杂质族	合理机理	产品后果	最佳控制点	分析确证	证据等级
原料	可被掺入的构建单元杂质，及其造成的插入	错误的对映体或非对映体；以 Ile 代 Leu；β-Ala 衍生物；游离氨基酸使某残基偶联两次；乙酸封端肽链	立体异构体；标称分子量相同的肽；重复残基；被封端的截短链	构建单元质量标准	手性 GC-MS；MS/MS；RP-HPLC 看不到乙酸	EMA 指南与 Fmoc 综述；替尔泊肽含三个 Ile、两个 Leu
装配	缺失序列与截短（被封端）序列	任一循环中偶联或脱保护不完全；失败的链随后被乙酰化	在许多位点中任意位置缺少残基的链；被封端的链更易分离	偶联过程控制；重复偶联；在有阻力的位点采用加强条件	RP-HPLC 联用 MS；肽图用于定位	一般性；两份原研披露都加强了 Ile12→Aib13，其中一份在自身实施例中点名了九个需延长偶联的位点
装配	差向异构化	在被活化的α-碳上形成噁唑酮	产品的非对映异构体	氨基甲酸酯型保护；添加剂；温度；活化时间	手性 GC-MS；对照差向异构体标准品的 LC	一般性；EPAR 记载使用了手性 GC-MS
装配	天冬酰亚胺及其开环产物	碱介导下在 Asp 处形成环状酰亚胺，随后水解或受胺进攻	α/β异构体与差向异构体，其中数种分子量接近	Asp 保护基选择；碱的组成；暴露时间	RP-HPLC 配真实标准品	一般性；在本品中的发生情况未经确立
装配	酯肽（depsipeptide）异构体	形成酯键而非酰胺键；确切位置在已公开文本中未经确立	产品的异构体，分子式相同	碱介导转化回产品（pH 8.5–9.5），而非去除	色谱；转化行为	在 WO2020159949A1 中被命名、量化为粗品的10%–15%，并列入权利要求
片段偶联	片段相关变体	偶联不完全；带入有缺陷的片段；残留活化物种	较大的截短物种，或全长的非对映异构体或缺失变体	片段放行检验；淬灭与纳滤	片段层面 LC-MS；终产品肽图	仅限混合路线；水平未公布
脂化	缀合程度与位点：未缀合肽、多重缀合、错位酰化	Lys20 脱保护或酰化不完全；过度酰化；Lys16 正交性失效	没有侧链；双酰化链（分子量不同）；或与产品分子式相同的 Lys16 酰化物种	脱保护与酰化过程控制；化学计量；保护完整性	前两者用完整分子量；用 MS/MS 肽图定位	在 EMA 指南中有一般性记载；本文所查阅资料中未报告 Lys16 酰化的替尔泊肽杂质
脂化	连接单元组成变体	构建单元中 AEEA 数目、谷氨酸数目或顺序错误	侧链被改变的全长肽	侧链中间体质量标准	构建单元的 LC-MS；产品的 MS/MS	专利权利要求中存在相关结构
裂解	侧链被烷基化；脱保护不完全	保护基以活性阳离子形式释放；残留 tert-butyl 或 Boc	Trp 或 Tyr 被修饰；或出现确定的分子量增量	清除剂配方；裂解时间	RP-HPLC 联用 MS；完整分子量	EMA 指南；Trp 的缓解措施有文献记载（Fields & Fields 1993）
纯化／贮存	降解产物与高分子量物种	氧化、水解、异构化、脱酰胺、二酮哌嗪与焦谷氨酸形成；二聚体与寡聚体；自缔合	多种；另有大于目标分子的物种	保持时间；温度；溶剂；浓度；贮存条件	稳定性指示方法；SEC	EMA 指南的途径清单；EPAR 质量标准中含 SEC；EPAR 记载在贮存条件下未观察到降解

表3. 按制造阶段划分的杂质图谱。加粗条目有产品专属的公开证据；其余为一般机理，其在本品中的相关性需产品专属确认。

酯肽那一行是公开资料中最清晰的产品专属案例，而该专利具体到值得细读。在公开的线性实施例中，粗品溶于1:1乙腈／水，并用氨水将pH升至8.5–9.5，以启动据称占粗品10%–15%的酯肽异构体向替尔泊肽的转化，保持至少一小时；权利要求把这一条件泛化为pH 7–10。该专利用的词是转化，而不是去除：酯肽是与产品共享分子式的酯连接异构体，而公开的这一步是把它变回产品，而不是把它分离出去。同一次溶解保持过程还会把一种色氨酸 CO₂ 盐转化为替尔泊肽，总计至少七小时。对这一点所能支持的范围有两条限制。该专利使用的是复数形式的"异构体"，并且只以一个序列编号来定义它们，而该编号对应的结构在已公开文本中无法机读，因此本文所查阅的公开披露并不能确立同样的酯键或同样的形成途径适用于每一条替尔泊肽路线；并且未报告转化收率，因此其中没有任何内容暗示定量回收。替尔泊肽确实含有五个丝氨酸和两个苏氨酸，这类酯可能位于其中。

为什么纯化无法修复每一处上游错误

反相色谱按疏水性分离：当失败产物在这一点上与产品不同时它很有效，不同之处不在这一点时则效果不佳。

有利的情形是真实存在的：缺少数个残基的、被乙酰化的截短链，或带有第二条 C20 链的物种，其差异足以在成熟的制备方法上被分开——这是一门成熟的学科，在载样量、选择性和回收率方面有大量文献（R. S. Hodges, T. W. Lorne Burke, C. T. Mant, J. Chromatogr. A 1988, 444, 349–362），在为此开发的固定相方面也是如此（L. F. Lloyd, M. B. Millichip, C. M. Watkins, J. Chromatogr. A 2002, 944, 169–177）。

不利的情形定义了控制策略。39肽中缺失一个残基只会轻微改变疏水性；差向异构体的改变更小；侧链位置异构体或酯肽异构体则完全不改变组成。针对天冬酰亚胺这一族，Fmoc 综述说得很直接：哌啶副产物在多数情况下可用 RP-HPLC 轻易分开，但"resolution of the epimerised α-aspartyl peptide is very difficult or impossible"——这是该综述针对其自身语境给出的判断，也是对这一极限最锐利的已发表表述（另见 R. Subirós-Funosas, A. El-Faham, F. Albericio, Tetrahedron 2011, 67, 8595–8606；关于强制条件下的消旋与天冬酰亚胺，见 S. A. Palasek, Z. J. Cox, J. M. Collins, J. Pept. Sci. 2007, 13, 143–148）。

欧洲指南把这一限制写入自身的预期，而不是把它当作缺陷：目标肽与结构相关的前洗脱和后洗脱杂质并非总能完全分离，因此需要收集馏分并合并纯度最高的部分，纯度较低的侧馏分可在单独的可接受标准下重新纯化，而常规的重新纯化属于制造过程而非返工处理——因而落在工艺验证范围内。

纯化是一份选择性预算，而不是一个过滤器：为回收收率而放宽收集窗口，会让更多结构相近的物种进来；收窄它则会丢弃产品。公开的线性路线用了两次顺序反相纯化、切向流过滤、共进料沉淀和一次加湿步骤，才从70%–90%的粗品做到97.7%以上、收率46%。正是这道算术说明了为什么上游预防——更好的偶联、更洁净的构建单元、一个可以被拒收的中间体——通常比下游的分辨更有价值。

分析必须分辨的不只是分子量

分析方案要回答四个不同的问题，而把它们混为一谈是阅读检验报告时最常见的错误。

检出问的是某个物种是否能被看见；该指南要求使用具有适当下限范围的高度专属方法。鉴别问的是它是什么，而完整分子量只能缩小范围、不能收口：它无法区分酯肽异构体、以 Ile 代 Leu 的取代，或一个差向异构体，因为这三者都与产品共享分子式。定位一处修饰需要碎裂信息——MS/MS 测序，或肽图。定量问的是有多少，此处参考标准品变得关键：没有标准品也可以对一个峰积分，但要给出浓度和限度通常做不到。界定问的是某一水平在安全性上是否可接受——这是毒理学与临床问题，不是分析问题。

最后这一点需要小心，因为阈值的适用边界并不自动成立。ICH Q3A(R2) 在其前言中指出多肽属于该指南未覆盖的原料药类型（ICH, Q3A(R2), Step 4 version, 25 October 2006），而2025年的欧洲多肽指南之所以存在，部分原因正是合成多肽完全或部分落在 ICH Q3A/B、Q6A/B 和 M7 的范围之外。但2022年的 EPAR 仍然记载了该产品按 Q3A 阈值完成界定。两者都成立：小分子阈值并不自动适用于一条复杂的合成多肽，而一次具体的审评仍然可以得出应用它们是合理的结论。不可辩护的是按默认方式直接套用。

立体化学有其自身的方法学陷阱，而该指南的解法相当精巧。酸水解后做手性 GC 是定量 D-氨基酸含量的标准做法，但水解本身就会诱发一定程度的差向异构化，于是分析会测到自己刚刚造出的缺陷。该指南描述的做法是在氘代盐酸中进行水解，这样在水解阶段发生的差向异构化会产生氘代氨基酸，可由与手性 GC 串联的质谱检测器区分开来。

从原料到必须被证明的内容

把这些资料合起来看，它们描述的是一套分布在整条工艺上、而不是集中在放行处的控制策略。受保护氨基酸的质量标准要覆盖常规纯度方法看不到的属性——对映体与非对映体含量、β-丙氨酰物种、游离氨基酸、乙酸。Aib 和脂肪侧链中间体是非大宗投入物，其供应商或路线变更即为原料药工艺变更。树脂载量——在公开实施例中约为0.65–0.76 mmol/g——是一个带有杂质后果的工艺参数，而不是一个目录编号。Lys20 的正交步骤自带其残留物问题，一条路线用钯、另一条用肼；而工艺参数包括特定位点的溶剂身份、流动停留时间，以及树脂结合中间体在−20 °C的贮存。最终放行按 EPAR 包括：以 RP-LC-UV、肽图和基于细胞的生物学测定进行鉴别；含量测定；以 RP-LC-UV 和 RP-LC-MS 测纯度；以 SEC 测高分子量物种；残留溶剂；水分；细菌内毒素；以及微生物限度。

下面的问题按"谁能回答"来区分；把它们全都当成供应商问卷，会把只有工艺所有方能做的工作分派错。

控制问题	责任方	预期证据
本构建单元中哪些杂质可在偶联中被掺入、如何限定，以及对映体含量、游离氨基酸和乙酸是用什么方法测定的？	构建单元供应商	基于反应性的分类并给出各自限度，而不是一个总量数字；以及能看到纯度测定看不到之处的方法
工艺在哪里出现阻力，在那里采用了什么条件？	多肽生产商／CDMO	位点层面的工艺知识——哪些偶联被延长、哪里保留了哪种溶剂，以及为什么
Lys20 脱保护与酰化的完成度如何确定，又如何证明侧链连在 Lys20 而不是 Lys16 上？	多肽生产商／CDMO	带数值目标的定量过程控制，外加一种能定位该修饰的方法
哪些杂质依赖最终纯化、哪些必须在上游控制，以及若有第二条路线并行运行，有哪些可比性数据支持？	申办方／工艺所有方	按杂质族给出的走向与清除评估；原料药可比性，对复杂多肽还需制剂层面的可比性
路线、构建单元供应商或保护基策略的变更如何评估？	质量协议	通知义务，以及明确要求重新确立杂质谱
这些方法能否区分分子量相同的变体——差向异构体、酯肽、以 Ile 代 Leu 的取代？	申办方与生产商共同	针对真实标准品展示出的分辨能力，而不是关于专属性的声明

表4. 替尔泊肽这一类产品制造中的控制问题，按谁能真正回答来分组。

结论

替尔泊肽制造的困难，既不单独来自链长，也不单独来自脂化或纯化，而是来自它们之间的耦合。

长链意味着事件很多，每一个都带有一个会累积相乘的小失败概率。一个受阻的非天然残基意味着平均偶联条件并非处处成立，而原研自己的文件点出了在它们的实施例中哪里不成立。第二个未被修饰的赖氨酸意味着选择性酰化必须被设计出来，而不能被假定。一条支链侧链意味着有第二条供应链汇入后果最重大的那一步。而按疏水性分离的纯化意味着，与产品最相似的那些失败产物——差向异构体、酯肽异构体、分子量相同的取代——最不容易被去除。

由此带来的结果是：控制策略必须是分布式的，而不是集中式的。构建单元、某次脱保护或某次偶联上的一点偏差，通常不会以明显失败的形式宣告自己；它会转化为一个长度正确、分子量接近、结构不同且难以清除的终产品杂质。正因如此，关于这样一个工艺，最有信息量的问题不是它能达到多高的纯度，而是它已经不可能再犯哪些错误。

常见问题

替尔泊肽是通过重组表达制造的，还是化学合成的？

化学合成。欧洲审评报告将该原料药描述为一条39个氨基酸的合成多肽，采用固相多肽合成并经色谱纯化制得。其中两个残基以及整条 Lys20 侧链都不是可编码的，因此纯重组路线若不再加化学步骤，无法得到这个分子。

为什么一条39个残基的多肽难以稳定合成？

因为逐步装配会累积相乘：大约38次偶联和数量相近的脱保护，每一次都必须以很高的效率成功，才能让大多数链达到全长，而失败产物是序列变体，不是明显不同的化合物。在线性路线中，也没有一个可在其处抓住错误步骤的已分离中间体。

为什么替尔泊肽在一个特定的赖氨酸上脂化？

C20脂肪二酸能实现白蛋白结合，从而延长半衰期并支持每周一次给药——原研发现论文和说明书都如此陈述。在制造层面，要求是选择性：该分子含有两个赖氨酸，Lys20 是已定义的位点，而在已定义的结构中 Lys16 未被修饰。公开路线在 Lys20 上使用正交保护基——化合物专利中以钯催化剂脱除 Alloc，工艺专利中以肼脱除 ivDde——同时 Lys16 保持受保护直到最终裂解。至于 Lys16 被酰化的物种是否曾以具有实际意义的水平形成，本文所查阅的资料中并未报告。

与完全线性的路线相比，SPPS/LPPS 混合路线改进了什么？

在公开路线中，它让较短的片段可以并行搭建、纯化并在组装之前放行，因此片段内部的缺陷可以被拒收，而不是被带到最后；随后纳滤或切向流过滤会在各次溶液相偶联之间除去试剂。它同时也引入了线性路线所没有的风险，主要是每个被活化的片段C端的差向异构化以及片段偶联不完全。它重新分配风险，但并不消除风险，而公开资料并不能确定当前使用的是哪一条路线。

最终的 HPLC 纯化能去除所有与替尔泊肽相关的杂质吗？

本文所查阅的资料并不支持这种预期。已通过的欧洲多肽指南指出，目标肽与结构相关的前洗脱和后洗脱杂质并非总能完全分离，并把馏分合并与侧馏分重新纯化纳入预期的工艺之中。与产品共享分子式的物种最不容易被分开——正因如此，预防与中间体控制承担了更大份额的负担。

为什么替尔泊肽难以制造：序列组装、脂化与杂质控制